液相色谱-三重四级杆质谱联用仪在雷尼替丁NDMA杂质检测中的应用实例
作者：上海熙华
王吉超、黄浩集
NDMA（N-二甲基亚硝胺），本是一个普普通通的化合物，却因为2018年的缬沙坦事件红遍大江南北，直至冲出亚洲走向世界。就在人们慢慢熟悉它、了解它，并觉得可以检测它、控制它的时候，诺华又爆出其雷尼替丁中NDMA超标，继而又在传统老药-二甲双胍中发现了它的存在。真是一波未平，一波又起……
值得注意的是，有报道称雷尼替丁在使用HS-GC-MS/MS方法检测的时候，会出现假阳性结果。有研究表明，该结果是因为部分雷尼替丁样品在GC进样口的高温环境下降解产生NDMA导致（图1）。也许是冥冥之中早有定数，雷尼替丁作为一个普通的组胺H2受体阻断剂，早在2012年【1】和2014年【2】就被当作模型化合物用于研究三级胺的亚硝酸化反应（图2）。上述文献显示，雷尼替丁在氧化剂的作用下（NH2Cl，注意不是氯化铵，该化合物是一种消毒剂）作用下，能够通过一系列复杂的分子内反应生成NDMA。
综上，为了应对假阳性结果可能导致的冤假错案，FDA随即开发了一个LC-HRMS方法用于该产品NDMA杂质的检测（见附件，下载方式见下方“参考文献”区域）?；毓防纯凑飧龇椒ǎ泻芏嗑钪Γ?
首先，使用液相系统进行分离就避免了气相导致的API进样口热分解问题；其次，该方法使用了一根ACE C18-AR柱（C18链有芳香基团修饰），解决了NDMA这类大极性物质的保留问题。最后，因为使用了高分辨质谱，使得该方法具有非常优异的专属性，尽可能地避免了低分子量区的背景干扰，提高了方法的灵敏度。然而，对于大部分医药生产企业来说，用一套高分辨液质联用系统来做常规的定量分析与检测工作，无疑是奢侈也是不现实的。
说到定量，毫无疑问，还是应该请我们分析定量界的王者-三重四极杆质谱上场。虽然属于低分辩质谱，但由于其独特的结构设计（图3），通过Q1筛选母离子，Q3筛选碎片离子来滤过干扰，大大降低了噪音信号，提高了分析灵敏度（图4）。
为了考察三重四极杆质谱对NDMA的检测能力，我们从几台API 6500plus液质系统（市面上灵敏度和稳定性最突出的三重四级杆质谱）中随机选择了一台并开展了试验(图5)。通过条件摸索，可知NDMA质子加合物在常规CID（碰撞诱导解离）条件下，主要碎裂为m/z 43和m/z 58两种碎片离子，推测其可能通过丢失甲醇分子以及羟基自由基【3】得到上述碎片（图6）。鉴于该原理，我们使用m/z 43为定量离子，m/z 58作为定性离子。如图7所示，使用FDA官方公布的液相条件，１ng/mL下NDMA对照品的信噪比为20.3，2ng/mL时为61.7，六针峰面积的RSD为2.5％。在有雷尼替丁及其制剂加标的情况下，回收率在90%以上，结果令人满意。但另一方面，我们发现该方法的基线噪音异常地高。这也比较容易理解，因为NDMA质子化后，质荷比只有75，非常容易受到空气、溶剂以及缓冲盐体系中小分子杂质的干扰，导致噪音较大。
如上所述，三重四极杆质谱对NDMA的检测能力令人满意，我们相信类似的方法对于NDEA的检测效果会更佳。因为NDEA的分子量为102，受低分子量区杂质的干扰更小，理论上应该有更好的灵敏度。如图9所示，在0.1ng/mL浓度下，NDEA的信噪比达到55，证实了上述推测。
综上，虽然HS-GC-MS/MS和LC-HRMS在亚硝胺类杂质检测方面分别具有适用性广和专属性高的优势，但常见的三重四极杆质谱同样不落下风，且由于其保有量较高，定量效果好，更适合在药厂及检验检测机构中推广。
最后轻松一下，附上食品中常见亚硝胺类杂质的含量情况，爱吃腊制食品的朋友们可以算算今天摄入了多少NDMA。
1. Julien Le Roux, Hervé Gallard, Jean-Philippe Croué, Sébastien Papot, and Marie Deborde. NDMA formation by chloramination of ranitidine: kinetics and mechanism. Environ. Sci. Technol. 2012, 46 (20), 11095?11103.
2. Yong Dong Liu, Meric Selbes, Chengchu Zeng, Rugang Zhong, and Tanju Karanfil. Formation Mechanism of NDMA from Ranitidine, Trimethylamine, and Other Tertiary Amines during Chloramination: A Computational Study. Environ. Sci. Technol. 2014, 48 (20), 8653?8663.
3. Yuan Yuan Zhao, Xin Liu, Jessica M. Boyd, Feng Qin, Jianjun Li, and Xing-Fang Li. Identification of N-Nitrosamines in Treated Drinking Water Using Nanoelectrospray Ionization High-Field AsymmetricWaveform Ion Mobility Spectrometry with Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry. Journal of Chromatographic Science. 2009, 47, 92-96.
